::::: Peter White :::::

O QUE É UM GENE? DNA (ácido desoxirribonucléico) é uma grande molécula composta por quatro unidades básicas ligadas em uma longa cadeia. Imaginemos que cada uma dessas unidades seja uma letra e o cromossomo uma longa fileira de letras. Genes, então, seriam grandes letras espalhadas pelo cromossomo. Estas letras têm um significado especial para as moléculas ativas da célula, como se fosse instruções para o que elas estão prestes a "construir". Qualquer erro acarretaria em informação errada a qualquer destas moléculas fazendo com que seu trabalho não seja executado ou executado de forma errônea. Estes erros são chamados de MUTACÕES.
Existem basicamente dois tipos de mutações, dominante e recessiva.Todas as células do corpo (exceto esperma e óvulos) têm duas cópias de cada gene.A mutação dominante ocorre quando apenas uma dessas copias é defeituosa e mesmo assim o indivíduo é afetado.A mutação recessiva ocorre quando as duas cópias são defeituosas para tal mutação.

COMO OS CIENTISTAS ACHAM TAIS MUTAÇÕES?

Nos dias de hoje, há duas maneiras de se identificar mutações que causam doenças genéticas. A primeira seria achar "homólogos" caninos que causariam danos similares em animais diferentes, como ratos, camundongos ou humanos. Genes envolvidos em processos biológicos se mostram similares entre espécies. Sendo assim, cientistas podem clonar genes caninos e inseri-los em um rato e dai tirar lições valiosas. Como no projeto humano no qual se busca a exata ordem das "letras” no cromossomo, será de grande valor também para a pesquisa genética canina.
Tanto a mutação inesperada e como a suspeitada precisam ser clonadas e comparadas. No caso de PRA nos Setters irlandeses, o gene responsável foi primeiramente encontrado em um rato. A "letra" defeituosa não era a mesma, porém o gene era.

TESTE DIRETO

No caso da descoberta de uma exata mutação, o diagnostico é preciso.Para genes em que só uma letra foi alterada, há uma maneira simples de determinar a presença de mutações através de um teste de enzimas (chamado enzima de restrições) no qual reconhece a fileira de letras representando a região que envolve a mutação e como se encontra o gene no local de mutação.
A porção do gene envolvendo a mutação pode ser sintetizada prontamente em um laboratório por um processo chamado RCP (reação em cadeia polimerase).Este método permite que a região dos genes seja ampliada por uma pequena amostra e o DNA sendo prontamente analisado. Testes de DNA podem ser realizados com qualquer célula. Normalmente raspa-se algumas células da parte interior de sua bochecha com uma pequena escova.Todos os requisitos para se fazer mais DNA são colocados em um tubo de ensaio e então ele é produzido na maquina de RCP. O segredo está em colocar uma fileira de letras correspondentes para que a síntese ocorra de maneira correta. Depois disso, o DNA ampliado é então purificado e cortado com as restrições de enzimas. Duas enzimas devem ser usadas para diagnósticos, uma para a seqüência onde as "letras" estavam erradas e outra para a seqüência da mutação. Neste diagnóstico, você terá duas partes do Dna. Eles seriam separados e observados sob uma luz violeta.

Se o animal não possui mutações você apenas verá duas partes do dna. No entanto, se um dos cromossomos possui mutação, você verá três fragmentos de dna, dois do cromossomo de "letras” erradas e um terceiro maior que não pode ser cortado pela enzima.Neste exemplo, a coluna da esquerda conta com o dna inteiro, enquanto as colunas do meio e da direita foram cortadas pela enzima. A coluna do meio mostra que o cachorro será um portador.

Se o animal não possui a mutação, você verá somente duas peças de DNA. Se, contudo, um dos cromossomos leva uma mutação, você verá três fragmentos de DNA, os dois do cromossomo selvagem, e um terceiro maior, que não foi cortado pela enzima. Neste exemplo mostrado, a coluna da esquerda, contém DNA intacto e as colunas da direita e do meio foram cortadas com uma enzima que reconhecem a seqüência de tipo selvagem. A coluna do meio mostra as duas faixas esperadas de um cachorro que é puro, enquanto a coluna direita mostra que aquele cachorro é um portador (três faixas). Um cachorro afetado daria uma única faixa.

A diagnose deve então ser repetida com a enzima que reconhece a mutação. Esta é essencial porque a digestão com a enzima de tipo selvagem pode ser incompleta, e produtos falsos podem eventualmente ser sintetizados. Ambas destas possibilidades devem ser consideradas. Se alguma destas ocorrer, o animal deverá ser re-testado. Recomenda-se que se um portador é identificado dentro de um grupo de cães, ele seja re-testado para que não tenha dúvida de uma improvável mistura de exames no laboratório.

TESTE DE ENCAMINHAMENTO

O segundo e menos apurado caminho para identificar mutações é conhecido como encadeamento. Espalhados ao longo dos cromossomos, existem pequenos grupos de letras repetidas conhecidas como micros satélites. (por exemplo, CACACACACACA). Estes podem variar em extensão de repetição, de indivíduo para indivíduo, e são, portanto a que se refere como extensão de seqüência simples polimorfismo (SSLP - simple sequence length polymorphisms). Centenas destas seqüências tem sido isoladas do genoma canino como ferramentas para genes de cartografia. Pois SSLP´s pode variar em extensão entre indivíduos, podendo ser usados para localizar genes defeituosos. Para achar um micro satélite local que é ligado a uma característica, você necessita de uma "família" de cães com o mesmo pedigree. As constatações de mesmas doenças de cães dentro do pedigree é feito por meios bioquímicos ou por exame físico, dependendo no “defeito”. Por exemplo, no caso de intoxicação de cobre em Bedlington Terrier, os animais foram determinados como afetados ou inalterados por uma biópsia de fígado e uma análise de cobre quantitativo (Yuzbasiyan-gurkan, e em outra parte; AJVM, 58:23-27, 1997). Conhecendo os estados/doenças dos cães, o cientista pode olhar para um micro satélite local que é ligado a presença da doença. Centenas de marcadores devem ser examinadas antes de um encadeamento com doença a um micro satélite achado.
Um micro satélite ligado co-segrega com o gene. Quanto mais próximo o marcador é ligado à doença, mais apurado é o teste. Para isso necessitaríamos de um bom número de membros familiares. Assim para achar um gene com este método, é relativamente um trabalho intensivo.
Aqui está como os produtos de uma amplificação de uma SSLP, que está vinculado a um gene de doença genética, se pareceria quando separado pelo gel matriz, por Mary Whiteley, Ph.D.

Em animais afetados, ambas as cópias dos micros satélites (um de cada cromossomo) são a mesma (neste caso são maiores) e ambas as formas dos indivíduos não-afetados são menores. Você deve estabelecer uma correlação entre a maior ou menor versão do micro satélite e o indivíduo não afetado. Em outra família, a versão menor pode ser encontrada nos animais afetados porque cromossomos podem recombinar, e a longa seqüência do micro satélite pode haver atravessado ao cromossomo, carregando o tipo selvagem.

Devido a isto, o genótipo de animais não pode ser determinada com certeza absoluta. Acuidade é geralmente em torno de 95-99%, tornando o teste uma trivialidade. É necessário que isolem o DNA de um animal, síntese do DNA usando base a um dado micro satélite local, e separando os produtos com o gel matrix. Porque a contaminação é um risco sempre presente, os controles negativos precisam ser incluídos no diagnóstico experimental. O isolamento de um micro satélite interligado identifica uma região específica do genoma estreitando as opções de busca de um gene específico causador de uma doença e assim pode, em última instância, conduzir a um teste específico.

O QUE O FUTURO NOS RESERVA

A área de prova genética em cães é tão ativa que a predição é que dentro de uma década, haverá testes genéticos para a maioria das doenças genéticas em cães. Igualmente, poderemos um dia fazer testes de características de comportamento. Uma nota importante para criadores é que informação deve ser usada cuidadosamente, para então fazer escolhas adequadas para procriação a fim de manter a diversidade genética na raça. No caso de doenças recessivas, se um portador procria um puro, nenhum dos filhotes serão afetados; contudo existe 50% chance que aqueles indivíduos sejam portadores. Igualmente, existe 50% de chance que o filhote será normal.
Filhotes testados podem ser usados para, gradualmente, eliminarem o problema da raça, sem alterar os genes.

Fonte: Projeto da Diversidade Canina
www.canine-genetics.com/index.htm

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